单细胞分析系统的组成（Seurat | 强烈建议收藏的单细胞分析标准流程（基础质控与过滤）（一））

1. 写在前面

作为现在最火

的scRNAseq分析包 
    
    
，Seurat当之无愧    
    
    。😘

本期开始我们介绍一下Seurat包的用法
     


     


    ，先从基础质控和过滤开始吧  


     


     


。🥳

2.用到的包

rm(list = ls()) library(Seurat) library(tidyverse) library(SingleR) library(celldex) library(RColorBrewer) library(SingleCellExperiment)

3. 示例数据

3.1 读取10X文件

这里我们提供一个转成gene symbols的可读文件 




 




 


，如果大家拿到的是Ensemble ID 

   

   

，可以用之前介绍的方法进行转换


 




 




。

adj.matrix <- Read10X("./soupX_pbmc10k_filt")

3.2 创建Seurat对象

srat <- CreateSeuratObject(adj.matrix,project = "pbmc10k") srat

3.3 查看Seurat对象

str(srat)

4. 提取meta.data

这里我们提取一下meta.data
     

     

   ，顺便查看一下表头  




  




  

，主要是三列: 👇

dataset ID； UMI/cell (nCount_RNA); detected genes/cell (nFeature_RNA)   

   

   。 meta <- srat@meta.data head(meta)

5.添加信息

5.1 添加线粒体基因信息

不知道大家还记得线粒体

基因吗???🤒

在scRNA-seq中 


  


  


，线粒体基因高表达往往代表细胞状态不佳   

     

     

。🧐 srat[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(srat, pattern = "^MT-") head(srat$percent.mt)

5.2 添加核糖体基因信息

这里我们试一下添加核糖体基因的信息



  




  




。👀

srat[["percent.rb"]] <- PercentageFeatureSet(srat, pattern = "^RP[SL]") head(srat$percent.rb)

6. 去除双细胞

scRNAseq的理想情况是每个barcode下只有一个细胞
     
     
  ，但在实际情况中会有两个或多个细胞共用一个barcode   




   




   
，我们称之为doublets  


  


  。🫠

识别并去除doublets的方法很多 



 



 



，常用的有：👇

Scrublet; doubletCells; cxds; bcds; Hybrid; DoubletDetection; DoubletFinder; Solo; DoubletDecon    
     
     
。

这里推荐大家使用DoubletFinder           ，我们就不进行演示了
    




    




    ，以后再做具体介绍




   




   




。🤗

因为我们事先使用Scrublet做过处理了














，这里就直接导入准备好的文件吧 



 



 。

doublets <- read.table("./scrublet_calls.tsv",header = F,row.names = 1) colnames(doublets) <- c("Doublet_score","Is_doublet") srat <- AddMetaData(srat,doublets) head(srat[[]])

7. 可视化

7.1 小提琴图

这里我们用VlnPlot探索一下特征的分布情况               。

VlnPlot(srat, fill.by = "feature", # "feature", "ident" features = c("nFeature_RNA","nCount_RNA","percent.mt","percent.rb"), ncol = 4, pt.size = 0.1) + theme(plot.title = element_text(size=10))

7.2 散点图

这里利用散点图           ，我们看一下不同变量间的相关性




    




    




。

FeatureScatter(srat, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt") FeatureScatter(srat, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA") FeatureScatter(srat, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.rb") FeatureScatter(srat, feature1 = "percent.rb", feature2 = "percent.mt") FeatureScatter(srat, feature1 = "nFeature_RNA", feature2 = "Doublet_score")

Note!

这里我们可以看到高线粒体基因与低UMI计数相关
     



     



     ，可以理解为死细胞










。 🫠 再看一下核糖体基因与线粒体基因













，显著负相关               。 😉 doublet和基因表达数之间也有一定的相关性 



     



     



。

8. 添加信息

8.1 过滤

接着我们定义一下过滤条件 
    
    
，将质量差    
    
    、非单细胞的数据剔除掉











。🫵

srat[[QC]] <- ifelse(srat@meta.data$Is_doublet == True, Doublet,Pass) srat[[QC]] <- ifelse(srat@meta.data$nFeature_RNA < 500 & srat@meta.data$QC == Pass, Low_nFeature, srat@meta.data$QC ) srat[[QC]] <- ifelse(srat@meta.data$nFeature_RNA < 500 & srat@meta.data$QC != Pass & srat@meta.data$QC != Low_nFeature, paste(Low_nFeature, srat@meta.data$QC, sep = ,), srat@meta.data$QC ) srat[[QC]] <- ifelse(srat@meta.data$percent.mt > 15 & srat@meta.data$QC == Pass, High_MT,srat@meta.data$QC ) srat[[QC]] <- ifelse(srat@meta.data$nFeature_RNA < 500 & srat@meta.data$QC != Pass & srat@meta.data$QC !=High_MT, paste(High_MT,srat@meta.data$QC,sep = ,), srat@meta.data$QC ) table(srat[[QC]])

8.2 可视化

这里我们只将通过过滤条件的数据展示出来
     


     


    ，大家可以和过滤前的比较一下    
    
    。

VlnPlot(subset(srat, subset = QC == Pass), features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt","percent.rb"), ncol = 4, pt.size = 0.1) + theme(plot.title = element_text(size=10))

最后祝大家早日不卷!~

需要示例数据的小伙伴 




 




 


，在公众号回复Seurat获取吧！

点个在看吧各位~ ✐.ɴɪᴄᴇ ᴅᴀʏ 〰